Carla Gugino est d'origine italo-anglo-irlandaise. A l'âge de 15 ans elle commence une carrière dans le mannequinat, à New-York, et ce malgré une taille jugée trop petite (1m65). Mais l'expérience ne lui plait pas, et elle part s'installer en Californie, où elle prend des cours d'art dramatique.
Elle fait ses débuts au cinéma et à la télévision à la fin des années 80, avant de voir sa carrière véritablement démarrer au milieu des années 90, avec des films comme Jaded ou bien encore Snake Eyes.
Au début des années 2000, elle obtient l'un de ses rôles phares, celui de l'espionne Ingrid Cortez dans Spy Kids de Robert Rodriguez. Elle reviendra jouer pour le réalisateur dans les deux suites, ainsi que dans Sin City.
Elle obtient ensuite de nouveau un succès commercial avec une nuit au musée, puis avec American Gangster de Ridley Scott. En 2009, elle joue la super-héroïne à la retraire Sally Jupiter dans le Watchmen de Zack Snyder.
On voit aussi l'actrice dans le film d'horreur Unborn, ou bien encore dans la comédie made in Disney La Montagne ensorcelée.
 
Côté vie privée, elle vit avec le réalisateur Sebastian Gutierrez, qui l'a fait jouer dans la série Karen Sisco , ainsi que dans les films Rise, Women in trouble et Elektra Luxx.