Né en Angleterre, Sam Worthington n'en reste pas moins australien, pays où il a vécu toute son enfance. A 17 ans, il suit sa petite amie de l'époque qui veut s'inscrire à la prestigieuse National Institute of Dramatic Art de Sydney. Elle y est refusée et lui y est accepté, à sa grande surprise. En 1998, il ressort du NIDA avec un diplôme d'art dramatique.
Sam Worthington commence alors une carrière télévisuelle, tout d'abord en Australie, puis aux Etats-Unis (dans la série J.A.G.). En 2000, il obtient son premier rôle au cinéma dans Bootmen de Dein Perry. Premier film et premier succès, l'acteur se voyant cité à l'Australian Film Institute en tant que meilleur second rôle masculin.
Il obtient dès lors nombre de seconds rôles, dont un dans le Mission évasion de Gregory Hoblit où il fait face à Bruce Willis et Colin Farrell, ou bien encore Dirty Deeds de David Caesar, avec son compatriote Sam Neill.
Il est ensuite sur la A-list pour remplacer Pierce Brosnan dans Casino Royale, avant que le rôle de l'agent secret ne revienne à Daniel Craig.
Enfin, James Cameron l'engage pour son film marathon en 3D, Avatar. Le cinéaste recommande alors l'acteur aux producteurs de Terminator Renaissance (lui qui est à l'origine de la franchise). En 2009 les deux films cartonnent au box-office et Sam Worthington devient une star.
En 2010, il est en tête d'affiche du choc des Titans de Louis Leterrier et de Last Night, où il côtoie Eva Mendes, Keira Knightley et Guillaume Canet.