Rose Byrne se tourne vers le métier d'actrice très tôt, puisqu'elle prend ses premiers cours de comédie à l'âge de huit ans. Elle passera de l'Australian Theatre for Young People à l'Université de Sydney, puis enfin, à partir de 1999, elle perfectionnera son jeu au sein de l'Atlantic Theatre Company.
elle fait ses débuts au cinéma en 1999, à l'âge de treize ans, dans Dallas Doll. Elle apparaît par la suite dans de nombreuses productions australiennes (dont Two Hands, aux côté d'Heath Ledger). En 2000, elle est récompensée au Festival de Venise (catégorie meilleure actrice), pour son rôle dans la déesse de 1967.
En 2002, elle fait ses débuts à Hollywood, dans Star Wars épisode II: l'attaque des clones, puis la même année dans City of Ghosts. En 2003, en Angleterre, elle tourne Rose et Cassandra, ainsi que trois films dans son Australie natale: The Night We Called It a Day, The Rage in Placid Lake et Take Away.
En 2004, elle tient le premier rôle féminin du film Troie (celui de la prêtresse Briséis). La même année, elle partage un autre film avec l'actrice Diane Kruger (Hélène dans Troie): Rencontre à Wicker Park, le remake américain du film français l'appartement.
En 2006, elle joue pour Sofia Coppola dans Marie-Antoinette; en 2007, pour Danny Boyle dans Sunshine, puis Juan Carlos Fresnadillo dans 28 semaines plus tard.
A partir de 2007, elle tiendra un rôle régulier dans la série Damages.
En 2009, elle joue pour Alex Proyas dans Prédictions, et en 2011 elle joue dans le film de super-héros X-Men Le commencement de Matthew Vaughn.
 
Elle a vécue de 2003 à 2010 avec le réalisateur et acteur australien Brendan Cowell