Actrice de théâtre réputée depuis la fin des années 80, Margo Martindale compte aussi une carrière cinématographique extrêmement riche, durant laquelle elle a côtoyé des stars telles que Leonardo DiCaprio (simples secrets), Hilary Swank (Million Dollar Baby), Nicole Kidman (jours de tonnerre, The Hours, les ensorceleuses, La couleur du mensonge), Russell Crowe (l'Echange), Meryl Streep (The Hours, simples secrets), et bien d'autres encore.
Elle est aussi connue pour avoir tenu le rôle de la grand-mère de Miley Cyrus dans Hanna Montana, le film, ainsi que pour avoir tenu un rôle récurent dans la série Dexter.