Santiago Segura commence par se faire la main sur des courts-métrages, et ce dès l'âge de 14 ans (grâce à une super 8 d'occasion). En 1989, il obtient un prix pour son court Relatos de Medianoche (au Cinema Jove de València). Le monde du cinéma s'ouvre alors à lui. Il enchaîne alors les jobs dans le milieu (doubleur, figurant, ...), avant de se faire reconnaître, en 1994, pour un autre de ses courts-métrages, Perturbado, qui sera récompensé d'un Goya.
Parallèlement, il commence à se faire un nom, cette fois-ci en tant qu'acteur, en particulier grâce à Alex de la Iglesia, qui lui offre un rôle dans son Action Mutante, puis l'année suivante pour le jour de la bête. Ce dernier film permettra à Santiago Segura d'obtenir un nouveau Goya, cette fois-ci en tant qu'espoir masculin. Enfin, en 1999, il est de nouveau récompensé, toujours aux Goya, mais ce coup-ci en tant que réalisateur, pour Le bras fou de la loi, premier film de la saga Torrente.
 
On le retrouve en guest star sur nombre de productions internationales, apparaissant par exemple dans les films de Guillermo Del Toro (Blade 2, Hellboy, et Hellboy II: les légions d'or maudites), Brian Yuzna (Beyond Re-Animator, et même dans le troisième opus cinématographique des aventures d'Astérix et Obélix: Astérix aux jeux olympiques.
 
Artiste versatile, Santiago Segura est une figure notable de la scène cinématographique ibérique, qui, en plus de ses activités précédemment citées, prête sa voix lors de doublages en langue espagnole.