Né de mère grecque et de père turc, Tcheky Kario a grandit à Paris. Il y fait des études d'art dramatique, et commence à jouer au théâtre des pièces classiques. Puis, il se tourne vers le cinéma qui très vite fait de lui une star. En 1983 il est en lice pour le César du meilleur jeune premier, et en 1986 il reçoit le Prix Jean Gabin, récompensant l'acteur français le plus méritant.
Après nombre de succès, Hollywood l'appelle, et il mène depuis une carrière internationale.
Il a travaillé avec quelques grands cinéastes comme Eric Rohmer (les nuits de pleine lune, en 1984), Jean-Jacques Annaud (l'ours, en 1988), Luc Besson (Nikita, en 1990, puis Jeanne d'Arc, en 1999), Ridley Scott (1492 : Christophe Colomb, en 1992), Michael Bay (Bad Boys, en 1995), Roland Emmerich (The Patriot, en 2000), Jean-Pierre Jeunet (le fabuleux destin d'Amélie Poulain, en 2001, puis un long dimanche de fiançailles, en 2004), Francis Huster (un homme et son chien, en 2008).
Il a aussi participé à la franchise James Bond, en 1995 pour Goldeneye.
 
Tout comme Jean Reno, qui mène lui aussi une carrière hollywoodienne, Tcheky Kario est très souvent engagé pour tenir le rôle du français.
 
Il est marié à l'actrice française Isabelle Pasco.