Mary Beth Peil suit des études de chanteuse d'opéra au Northwestern University, et remporte en 1964 un prix au Young Concert Artists Auditions (catégorie soprano).
A partir du milieu des années 60, elle travaille en tant que chanteuse d'opéra au Metropolitan Opera et au New-York City Opera. Les années 70 voient sa notoriété se consolider avant d'atteindre son apogée dans les années 80 (avec en 1985 une citation aux Tony Awards).
En 1992, elle fait ses débuts au cinéma, et en 1998 elle obtient un rôle récurrent dans la série Dawson's Creek.
Au cinéma, elle compte quelques apparitions, comme par exemple en 2004 pour Frank Oz dans Et l'homme créa la femme, en 2006 pour Clint Eastwood dans Mémoires de nos pères, ou bien encore en 2008 pour Alexandre Aja dans Mirrors.