Lambert Wilson est le fils de l'acteur et metteur en scène Georges Wilson. Avec des origines irlandaises (son arrière-grand-père paternel), il maitrise aussi bien la langue de Shakespeare que celle de Molière. Il suit des études d'art dramatique et de chant à Londres, au Center Drama, d'où il ressort diplômé en 1977.
Il obtient alors quelques rôles secondaires, dont un dans Julia de Fred Zinnemann. Le réalisateur lui offrira son premier grand rôle, face à Sean Connery, en 1982, dans Cinq jours ce printemps là. Mais avant cela, il jouera dans le culte Gendarme et les extra-terrestres, de Jean Girault, puis dans La Boum 2, de Claude Pinoteau, face à Sophie Marceau.
Il travaille ensuite pour quelques uns des plus grands noms du cinéma français: Claude Chabrol (le sang des autres), Andrzej Zulawski (la femme publique), André Téchiné (Rendez-vous), Yves Boisset (Bleu comme l'enfer), Andrzej Wajda (Les possédés), Philippe de Broca (Chouans), etc..
En 1989 son père le fait tourner dans La Vouivre, film où sa performance est saluée par les critiques. Mais c'est avec Hiver 54, toujours cette même année 1989 que Lambert Wilson s'installe définitivement comme un acteur incontournable de la scène française (il recevra le prix Jean Gabin pour se performance dans le film de Denis Amar).
A partir de là, Lambert Wilson touchera à pratiquement tous les genres cinématographiques: la comédie, avec Jet Set, le film en costume, avec Jefferson à Paris, la comédie musicale (On connaît la chanson), la science-fiction (Matrix Reloaded), le film de super-héro (Catwoman), le doublage de dessin animé (Tous à l'Ouest: Une aventure de Lucky Luke), le policier (Flawless), ou bien encore le thriller (Dédales).
Il aura même postulé pour le rôle de l'agent secret britannique, James Bond, pour Goldeneye, montrant bien que son aura dépasse grandement les frontières de l'Hexagone.
Lambert Wilson est aussi très actif au théâtre, jouant aussi bien en anglais (comme par exemple dans A Little Night Music, à Londres, en 1996, aux côtés de Dame Judi Dench) qu'en français (bien souvent mis en scène par son père, ou bien alors par lui-même, comme pour Bérénice, avec comme partenaire Kristin Scott Thomas, en 2002). De plus, il est depuis plusieurs années, le directeur du Théâtre National de Paris.
 
Chanteur de talent (avec une voix de baryton), Lambert Wilson a enregistré plusieurs disques: Musicals en 1989, Démons et merveilles en 1997 et Loin en 2007. De plus, il a régulièrement travaillé avec les plus grands musiciens classiques (comme Mstislav Rostropovitch ou bien encore Seiji Ozawa), dans le cadre de narrations (comme par exemple pour Pierre et le loup).
 
En 2007, il est fait Officier des Arts et des Lettres.