Tim Guinee a suivi ses études d'art dramatique à la Houston High School for Performing Arts. Il débute sa carrière au théâtre, à Houston, avant de venir s'installer à New-York, pour étudier à l'American Academy of Dramatic Arts. Il terminera ses études à la North Carolina School of the Arts de Winston-Salem.
Il est apparu dans de nombreux films, comme par exemple L'homme de guerre, Le patchwork de la vie, à l'épreuve du feu, Vampires, Blade, Iron Man et sa suite. Mais son rôle le plus connu est sans doute celui qu'il tient dans la série Stargate SG-1.
 
Il a rencontré sa femme, Daisy Foote, sur le tournage de Hallmark Hall of Fame: Lily Dale, en 1996.