Acteur d'origine portoricaine de part son père et afro-américain de par sa mère, Ruben Santiago-Hudson a fait ses études d'art dramatique à la Binghamton University, puis à la Wayne State University, pour enfin les terminer au Buffalo State College.
A la fin des années 80, il est au casting d'un prince à New-York, puis au début des années 90 on le croise dans Blown Away. Mais à cette période, sa carrière se joue sur les planches, à Broadway, et en 1996 il reçoit le Tony Awards pour sa performance dans la pièce Seven Guitars.
Il devient ensuite une figure importance de la télévision, avec des rôles dans des très nombreuses séries, comme New-York unité spéciale, New-York Police Blues, ou bien encore A la Maison Blanche.
En 2001, il écrit une pièce de théâtre, Lackawanna Blues, qui sera adaptée à la télévision en 2005; cette histoire est une autobiographie de l'acteur. Pour ce téléfilm, Ruben Santiago-Hudson recevra une citation aux Emmy Awards.