Nathan Fillion fait ses premiers pas sur les planches, y compris dans le théâtre d'improvisation. En 1994, il fait ses débuts à la télévision, en apparaissant dans le soap opera On ne vit qu'une fois, pour lequel son travail est salué par la critique. Il quitte la série en 1997 pour donner un nouvel élan à sa carrière, et déménage à Los Angeles. Il rejoint alors la série Un toit pour trois, puis obtient un petit rôle au cinéma dans le film de guerre de Steven Spielberg, Il faut sauver le soldat Ryan (où il joue l'un des frères Ryan à l'origine de l'histoire).
Cette même année il postule pour tenir le premier rôle masculin d'une série fantastique qui se monte: Angel dans Buffy contre les vampires. Il n'est cependant pas retenu. En 2002, il est cependant engagé, toujours dans un projet mené par Joss Whedon, pour tenir le premier rôle. Il s'agit de Firefly. C'est ce rôle qui rendra Nathan Fillion célèbre, et ce malgré l'échec en termes d'audimat de la série, qui se verra d'ailleurs prématurément arrêtée. Le projet renaîtra cependant de ces cendres, en 2005, avec une version cinéma, nommée Serenity. Entre temps, Joss Whedon fera appel à son actreur pour incarner le grand méchant lors du final de la dernière saison de Buffy contre les vampires, en 2003.
Depuis, Nathan Fillion a pu être vu sur quelques productions fantastiques et horrifiques (Horribilis, La Voix des morts: La lumière), ainsi que sur nombres de productions T.V., et en particulier des doublages (Wonder Woman, La Ligue des justiciers). Il tiendra aussi un rôle récurrent dans la série Desperate Housewives.
Il effectuera aussi le doublage du jeu vidéo Halo 3: ODST, avec deux de ses anciens collègues de Firefly, Adam Baldwin et Alan Tudyk.