Bien que né en Colombie, John Leguizamo a pour ainsi dire vécu tout sa vie aux Etats-Unis, puisqu'il quitte définitivement le pays qui n'a vu naître lorsqu'il est âgé de seulement trois ans. Ses parents et lui-même s'installent à New-York, où le jeune homme y ferra ses études. Déjà, à cette époque, ses camarades de classes remarquent sa diction effrénée qui deviendra plus tard sa marque de fabrique.
Il fait ses débuts d'acteur à la télévision en 1984 dans un épisode de Deux flics à Miami. Sur le grand écran il rejoint très vite les castings de prestigieuses productions hollywoodiennes, telles que Outrages en 1989, 58 Minutes pour vivre en 1990, et A propos d'Henry en 1991.
En 1993, il obtient un rôle de premier plan dans Super Mario Bros, où il tient le second rôle masculin. Même si le film est un échec, aussi bien commercial que critique, la carrière de l'acteur est lancée.
A partir de là, il sera présent aussi bien sur le petit que sur le grand écran, en chair et en os ou en tant que doubleur, comme par exemple dans la série L'Age de glace, où il double Sid.
Parmi ses films marquants on retrouve des films d'actions (Justice sauvage et Ultime Décision, tous les deux avec Steven Seagal), des films policiers (L'impasse, Summer of Sam), des drames (A propos d'Henry), des films de super-héros (Spawn, où il joue le méchant), des comédies (Dr. Dolittle), des comédies musicales (Moulin Rouge!), des films fantastiques Phénomènes, et même des films d'horreur (Land of the dead).