Il a effectué des études d'art dramatique à la Pasadena Community Playhouse, puis à New York, à l'Actor's Studio. Il commence sa carrière au théâtre en 1964, avant de se faire engager par Mike Nichols pour son film le Lauréat en 1967. Premier rôle, première nomination pour l'Oscar du meilleur acteur.
S'ensuivent grâce à cette reconnaissance les années fastes, où il enchaîne les rôles à un rythme soutenu, jusqu'à Kramer contre Kramer, en 1980, où il gagne son premier Oscar.
Pour beaucoup, le summum de son art sera atteint en 1988 lorsqu'il interprétera Charlie Bobbit dans le film rain man, pour lequel il reçoit son second Oscar. Il y joue un autiste, face à Tom Cruise, dans une interprétation spectaculaire, qui marquera l'image de l'acteur à jamais. Peut-être la meilleure interprétation de l'histoire du cinéma, tout acteur confondu.
Les années 90 sont moins marquantes dans la carrière de l'acteur, même s'il joue toujours énormément, et souvent avec de très grands réalisateurs, comme Steven Spielberg, Barry Levinson ou Wolfgang Petersen.
Les années 2000 le voient revenir dans des films au succès critiques ou financiers, avec des films comme Neverland, Mon beau-père, mes parents et moi, ou bien encore le parfum, histoire d'un meurtrier.
 
Les acteurs de cette trempe sont rares, très rares. Dans toute l'histoire d'Hollywood, seule une poignée peut prétendre avoir le talent ou la carrière de Dustin Hoffman.